酶底物法HJ1001-2018 标准版下载

    水质总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定酶底物法

    1、适用范围
    本标准规定了测定水中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的酶底物法。
    本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定。本方法的检出限为10MPN/L。
    2、规范性引用文件
    本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。
    GB/T6682分析实验用水规格和实验方法
    GB/T14581水质湖泊和水库采样技术指导
    HJ494水质采样技术指导
    HJ/T91地表水和污水监测技术规范
    3、术语和定义
    下列术语和定义适用于本标准。
    3.1
    总大肠菌群totalcoliforms
    37℃培养24h，能产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黄色的邻硝基苯酚的肠杆菌科细菌。
    3.2
    粪大肠菌群fecalcoliforms又称耐热大肠菌群（thermotolerantcoliforms）。44.5℃培养24h，能产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黄色的邻硝基苯酚的肠杆菌科细菌。
    3.3
    大肠埃希氏菌Escherichiacoli俗称大肠杆菌。37℃培养24h，能产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黄色的邻硝基苯酚，同时产生β-葡萄糖醛酸酶（β-Glucuronidase），分解选择性培养基中的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）释放出荧光物质（4-甲基伞形酮）的肠杆菌科细菌。
    3.4
    *大可能数mostprobablenumber（MPN）又称稀释培养计数，是一种基于泊松分布的间接计数法。利用统计学原理，根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性数，查表估算一定体积样品中目标微生物存在的数量（单位体积存在目标微生物的*大可能数）。
    4、方法原理
    在特定温度下培养特定的时间，总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌能产生β-半乳糖苷酶，将选择性培养基中的无色底物邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）分解为黄色的邻硝基苯酚（ONP）；大肠埃希氏菌同时又能产生β-葡萄糖醛酸酶，将选择性培养基中的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）分解为4-甲基伞形酮，在紫外灯照射下产生荧光。统计阳性反应出现数量，查MPN表，分别计算样品中总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌的浓度值。
    5、干扰和消除
    5.1活性氯具有氧化性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（8.1）时加入硫代硫酸钠溶液（6.4）消除干扰。
    5.2重金属离子具有细胞毒性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（8.1）时加入乙二胺四乙酸二钠溶液（6.5）消除干扰。
    6、试剂和材料
    除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水应满足GB/T6682中三级水的要求。
    6.1培养基。
    本标准采用MinimalMediumONPG-MUG培养基。每100ml样品需使用培养基粉末。
    2.7g±0.5g，所含基本成分如下：
    硫酸铵[(NH4)2SO4]0.5g
    硫酸锰（MnSO4）0.05mg
    硫酸锌（ZnSO4）0.05mg
    硫酸镁（MgSO4）10mg
    氯化钠（NaCl）1g
    氯化钙（CaCl2）5mg
    亚硫酸钠（Na2SO3）4mg
    两性霉素B（AmphotericinB）0.1mg
    邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）50mg
    4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）7.5mg
    茄属植物萃取物（Solanium萃取物）50mg
    N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐（HEPES钠盐）0.53g
    N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）0.69g
    也可采用市售商品化培养基制品。
    6.2硫代硫酸钠（Na2S2O3·5H2O）。
    6.3乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2O8Na2·2H2O）。
    6.4硫代硫酸钠溶液：ρ（Na2S2O3）=0.10g/ml。称取15.7g硫代硫酸钠（6.2），溶于适量水中，定容至100ml，临用现配。
    6.5乙二胺四乙酸二钠溶液：ρ（C10H14N2O8Na2·2H2O）=0.15g/ml。称取15g乙二胺四乙酸二钠（6.3），溶于适量水中，定容至100ml，此溶液保质期为30d。
    6.697孔定量盘：含49个大孔，48个小孔。其中，每个小孔可容纳0.186ml样品，大孔中48个大孔每个可容纳1.86ml样品，一个顶部大孔可容纳11ml样品。也可采用经环氧乙烷灭菌的市售商品化成品。
    6.7标准阳性比色盘。
    6.8无菌水：取适量实验用水，经121℃高压蒸汽灭菌20min，备用。
    7、仪器和设备
    7.1采样瓶：具螺旋帽或磨口塞的100ml、250ml、500ml广口玻璃瓶。
    注：在采集不存在或不考虑余氧、金属离子干扰的样品时，可采用市售无菌采样瓶或无菌采样袋。
    7.2高压蒸汽灭菌器：121℃可调。
    7.3恒温培养箱：允许温度偏差37℃±1℃、44.5℃±0.5℃。
    7.4程控定量封口机：用于97孔定量盘（6.6）的封口。
    7.5紫外灯：365～366nm。
    7.6移液管：1ml±0.01ml、10ml±0.1ml。也可采用计量合格的可调式移液器。
    7.7三角瓶：100ml。
    7.8量筒：100ml±1ml。
    7.9一般实验室常用仪器和设备。
    注：三角瓶、移液管、采样瓶等玻璃器皿及采样器具要在试验前按无菌操作要求包扎，121℃高压蒸
    汽灭菌20min，烘干，备用。
    8、样品
    8.1样品采集
    点位布设及采样频次按照GB/T14581、HJ/T494和HJ/T91的相关规定执行。采集微生物样品时，采样瓶（7.1）不得用样品洗涤，采集样品于灭菌的采样瓶中。采集河流、湖库等地表水样品时，可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中，约距水面10～15cm处，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使样品灌入瓶内然后盖上瓶塞，将采样瓶从水中取出。如果没有水流，可握住瓶子水平往前推。采样量一般为采样瓶容量的80%左右。样品采集完毕后，迅速扎上无菌包装纸。从龙头装置采集样品时，不要选用漏水龙头，采水前将龙头打开至*大，放水3～5min，然后将龙头关闭，用火焰灼烧约3min灭菌或用70%～75%的酒精对龙头进行消毒，开足龙头，再放水1min，以充分除去水管中的滞留杂质。采样时控制水流速度，小心接入瓶内。采集地表水、废水样品及一定深度的样品时，也可使用灭菌过的专用采样装置采样。在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，以免不同层次的搅扰。如果采集的是含有活性氯的样品，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液（6.4），以除去活性氯对细菌的抑制作用（每125ml容积加入0.1ml的硫代硫酸钠溶液）；如果采集的是重金属离子含量较高的样品，则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠溶液（6.5），以消除干扰（每125ml容积加入0.3ml的乙二胺四乙酸二钠溶液）。
    注：15.7mg硫代硫酸钠（6.2）可去除样品中1.5mg活性氯，硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯
    量调整。
    8.2样品保存
    采样后应在2h内检测，否则，应10℃以下冷藏但不得超过6h。实验室接样后，不能立即开展检测的，将样品于4℃以下冷藏并在2h内检测。
    9、分析步骤
    9.1样品稀释

    根据样品污染程度确定接种量（见表1），避免接种样品培养后97孔定量盘（6.6）出现全部阳性或全部阴性。接种量小于100ml时，应稀释样品后接种，接种量为10ml时，取10ml样品加入到盛有90ml无菌水（6.8）的三角瓶（7.7）中混匀制成1:10的稀释样品，其他接种量的稀释样品依次类推。对于未知样品，可选用多个接种量进行检测。

    9.2接种
    量取100ml样品或稀释样品于灭菌后的三角瓶，加入2.7g±0.5g培养基（6.1）粉末，充分混匀，完全溶解后，全部倒入97孔定量盘（6.6）内，以手抚平97孔定量盘背面，赶除孔内气泡，然后用程控定量封口机（7.4封口。观察97孔定量盘颜色，若出现类似或深于标准阳性比色盘（6.7）的颜色，则需排查样品、培养基、无菌水等一系列因素后，终止试验或重新操作
    注：9.1、9.2步骤在野外操作时应避开明显局部污染源，建议使用一次性手套、口罩、酒精灯等。
    9.3培养
    测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌时，将封口后的97孔定量盘放入恒温培养箱（7.3）中37℃±1℃下培养24h。测定粪大肠菌群时，将封口后的97孔定量盘放入的恒温培养箱中44.5℃±0.5℃下培养24h。
    9.4对照试验
    9.4.1空白对照
    每次试验都要用无菌水（6.8）按照步骤9.1～9.3进行实验室空白测定。培养后的97孔定量盘不得有任何颜色反应，否则，该次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定。
    9.4.2阴性和阳性对照
    总大肠菌群、大肠埃希氏菌、粪大肠菌群的阴性、阳性菌株参考表2。

     将标准菌株制成300～3000个/ml的菌悬液，将菌悬液按接种（9.2）和培养（9.3）要求操作，阳性菌株应呈现阳性反应；阴性菌株呈现阴性反应，否则，该次样品测定结果无效，应重新测定。
    注：可先制备较高浓度菌悬液，采用血球计数器在显微镜下对其浓度进行初步测定，然后根据实际情
    况用无菌水（6.8）稀释至300～3000个/ml。
    9.4.3结果判读与计数
    将培养24h后的97孔定量盘进行结果判读，样品变黄色判断为总大肠菌群或粪大肠菌群阳性；样品变黄色且在紫外灯（7.5）照射下有蓝色荧光，判断为大肠埃希氏菌阳性。如果结果可疑，可延长培养至28h进行结果判读，超过28h后出现的颜色反应不作为阳性结果。可使用保质期内的标准阳性比色盘以辅助判读，参见附录A。分别记录97孔定量盘中大孔和小孔的阳性孔数量。